Uvod

Spermogram i spermocitogram su dve analize sperme sa kojima treba započeti ispitivanje bračne neplodnosti. Analiza je brza , efikasna i jeftina. Osim toga, veliki broj podataka o kvalitetu spermatozoida na efikasan način ukazuju na to da li treba uključiti muškarca u proces lečenja. U slučajevima kada spermogram i spermocitogram pokazuju normalne vrednosti, tzv. muški faktor u tretmanu bračne neplodnosti treba ostaviti po strani, ali ne i potpuno zanemariti.

Spermogram je tzv. nativni pregled sperme. Ovim pregledom se dobijaju podaci o ukupnom broju spermatozoida, procentu progresivno pokretnih, ne-progresivno pokretnih, slabo pokretnih i nepokretnih spermatozoida. Osim toga, ovim pregledom se određuju i parametri kao što je zapremina, viskoznost, brzina likvefakcije, pH, boja ejakulata, kao i podaci vezani za aglutinaciju i agregaciju spermatozoida (vidi tabelu 1)

Spermocitogram je deo pregleda koji se obavlja na velikim mikroskpskim uvećanjima (više od 400X). Ovaj deo pregleda pruža informacije vezane za morfologiju spermatozoida. Osim toga vrši se i procena prisustva i broja drugih celija kao što su leukociti, eritrociti, epitelne ćelije, nezrele forme spermatozoida, bakterije itd.

 

Inkubacija

Novija istraživanja pokazuju da kratkotrajna inkubacija spermatozoida sa lipozomalnom frakcijom progesterona i/ili PGE1 dovodi do značajnog povećanja pokretljivosti spermatozoida i njihove sposobnosti da se vežu za zonu pelucidu. Zna se da je to osnovni preduslov oplođenja jajne ćelije. Ovakva priprema i kondicioniranje spermatozoida za inseminaciju je jednostavna procedura i neznatno poskupljuje samu intervenciju. Mehanizmi kojima progesteron i/ili PGE1 podstiču pokretljivost spermatozoida i akrozomalnu reakciju su bazirani na povećanju cAMP i “otvaranju” Ca 2+ kanala spermatozoidne membrane. Ovi kanali se nalaze pretežno u vratnom delu spermatozoida.

Dobijanje uzorka za analizu

Za dobijanje pouzdanih podataka tokom analize neophodna je minimalna priprema pacijenta koja podrazumeva apstinenciju u trajanju od 2-7 dana. Apstinencija ne sme biti kraća od 48 h zbog toga što u tom slučaju ovaj faktor može značajno uticati na ukupan broj spermatozoida. Apstinencija duža od 7 dana utiče na smanjenje broja progresivno pokretnih spermatozoida. Najbolje je da uzorak bude prikupljen u samoj laboratoriji ili da se u roku od 60 min. dopremi do laboratorije ukoliko temperaturni uslovi to dozvoljavaju (20-35 o C). Posuda u kojoj se uzorak prikuplja treba da bude od stakla ili plastike koja je testirana na netoksičnost prema spermatozoidima.

Likvefakcija

Likvefakcija ili “razvodnjavanje” sperme je proces koji se odvija pod uticajem enzima koji potiču iz prostate. U normalnim okolnostima likvefakcija se odvija maksimalno u roku od 60 min. Faktor temperature je veoma važan za kompletnu likvefakciju (idealna temperatura je 20-37 o C). Na ovoj temperaturi su svi enzimi optimalno aktivni u navedenom temperaturnom intervalu. Izostanak likvefakcije u roku od 60 min. ukazuje na poremećaj funkcije prostate.

Viskoznost

Viskoznost se ispituje Drop testom, odnosno tzv. Comhaireovim testom formiranja kapljice. Semena tečnost povećane viskoznosti otežava kretanje spermatozoida. Broj ćelija u semenoj tečnosti takođe utiče na viskoznost. Veća koncentracija ćelija čini semenu tečnost viskoznijom, dok smanjen broj ćelija (oligospermija) doprinosi smanjenju viskoznosti sperme.

 

Zapremina (volumen)

Zapremina normalnog ejakulata je veća od 2 ml. Smanjena zapremina ejakulata je najčešće udružena sa poremećajima spermatogeneze, funkcije semenih žlezdi i prostate.

 

 

Broj ćelija u ejakulatu

U normalnom spermogramu broj spermatozoida je veći od 20x10 6/cm 3 . Smanjen broj spermatozoida ukazuje na poremećaj spermtogeneze (procesa nastajanja spermatozoida) i zahetva temeljna ispitivanja u tom pravcu. Povećan broj ostalih ćelija kao što su leukociti, eritrociti, epitelne ćelije ili bakterije ukazuje na postojanje infekcije. Može ukazati i na zapaljenjski procesa autoimunske prirode. Kompjutersko prebrojavanje spermatozoida je doprinelo brzini, efikasnosti i preciznosti dobijanja ovih podataka.

 

 

Aglutinacija i agregacija

Spermatozoidi mogu biti slepljeni međusobno ili povezani u velike konglomerate posredovanjem nekih drugih ćelija kao što su granulociti, limfociti i makrofazi. Konglomerati spermatozoida i/ili drugih ćelija onemogucavaju bilo kakvo usmereno kretanje čak i normalnih spermatozoida. Međusobna slepljenost spermatozoida (rep-rep, glava-glava, glava-rep) je najčešće posredovana anti-spermatozoidnim antitelima. U ovom slučaju anti-spermatozoidna antitela deluju kao neka vrsta “lepka” između spermatozoida. Ukoliko su konglomerati spermatozoida posredovani nekim drigim ćelijama (najčešće leukociti) to je opet znak autoimunske reakcije na spermatozoide. Ove pojave su najčešće inicirane hronicnim zapaljenjskim procesima, povredama, hirurskim intervencijama i sl.

Pokretljivost

Pokretljivost spermatozoida je podjednako važna kao i njihov broj. Ukoliko je broj spermatozoida normalan uz prisustvo velikog broja slabo pokretnih ili nepokretnih spermatozoida, spermogram se ne meže kvalifikovati kao normalan. Pre kompjuterske obrade spermograma bilo je veoma teško proceniti kvalitet pokretljivosti spermatozoida. Ovo se događalo zbog nemogućnosti praćenja velikog broja ćelija u istom trenutku (10-200 u vidnom polju). Kompjuterska analiza putanja spermatozoida u vremenskom periodu od 5-7 sekundi je veoma olakšala ovaj posao i učinila ga mogućim i preciznijim. Primere putanja normalno pokretnih spermatozoida i pokretnih ali sa velikim brojm ne-progresivno pokretnih mozete videti na filmu 3 i 4 . Smatra se da samo progresivno pokretni, aktivirani i hiperaktivni spermatozoidi mogu doći u priliku da oplode jajnu ćeliju. Prema pokretljivosti, spermatozoidi se dele u 4 kategorije:

– (A) Rapidno progresivno pokretni (aktivirani, hiperaktivni) spermatozoidi.

– (B) Sporo progresivno pokretni (pokretni) spermatozoidi.

– (C) ne-progresivno pokretni (slabo i cirkularno pokretni) spermatozoidi.

– (D) nepokretni spermatozoidi.

Rezultanta krivudave putanje progresivno pokretnih spermatozoida je prava ili blago zakrivljena linija (najčešće u vidu S i C), pri brzini kretanja ne manjoj od 20 lm/s. Cirkularno pokretni spermatozoidi mogu da se krecu brzinom koja je cak veca od 20 lm/s. Rezultanta njihove putanje je kružnog ili spiralnog oblika bez znacajnog pomaka u prostoru.

Morfoogija spermatozoida

Radi lakšeg opisivanja i prepoznavanja morfoloških odstupanja i defekata spermatozoida ova ćelija je podeljena na glavu, tzv. “srednji deo”, vrat i rep. Silueta glave normalnog spermatozoida je predstavljena elipsom precnika 4 .0x5.5 mikrona . Manje varijacije u obliku i veličini glave su moguće i kod normalnih spermatozoida. Međutim, generalno je prihvaćeno da spermatozoidi sa manjom ili većom glavom, kao i oni čiji oblik značajno odstupa od normalnog predstavljaju abnormalne forme (kruškaste glave, tapering forme i sl). Moguće su i druge anomalije kao što su spermatozoidi sa dve glave.  Česti su i spermatozoidi sa morfološko-funkcionalnim defektom akrozomalne kape koja normalno treba da zauzima 30-50% zapremine glave.

Anomalije srednjeg dela se odnose uglavnom na pojavu tzv. cytoplasmic droplets formi spermatozoida. Samo u slučajevima kada je procenat ovih spermatozoida veći od 30% nalaz se smatra patološkim. Anomalije vrata se odnose na osu glave i repa u odnosu na sam vrat i srednji deo spermatozoida. Patološkim se smatraju one forme spermatozoida čija je osa vrata pod određenim uglom u odnosu na osu glave i/ili repa. Najčešće anomalije repa su kratak, dugačak, prelomljen, dupli, tzv. detached, hairpin i “Dag” forme repova. Normalna dužina repa je 35-45 mikrona.

Ostale analize

Ostale analize sperme se odnose na biohemijske parametre kao što je određivanje koncentracije fruktoze, cinka, kisele fosfataze itd. Imunološke analize se uglavnom odnose na detekciju anti-spermatozoidnih antitela u semenoj tečnosti Immunobead ili MAR testom. Ova antitela je moguće detektovati i u krvi ELISA testom. Bakteriološka ispitivanja se izvode putem analiza kao što je spermokultura. Ovom analizom se dobijaju podaci o prisustvu, vrsti i broju određenih mikroba koji mogu u značajnoj meri kompromitovati oplodnu moć muškarca. Na osnovu spermokulture (biogram) izrađuje se anti-biogram. ovim putem se dolazi do saznanja na koje antiobiotike su osetljivi mikrobi izolovani u spermokulturi

CASA – Computer Assisted Sperm Analysis

Kompjuterski asistirana analiza sperme (CASA) je sistem koji je sve više u upotrebi kako u razvijenim zemljama tako i kod nas. Radi se o potpuno automatizovanom ili poluautomatizovanom sistemu koji čine mikroskop, specijalna komora za analizu uzorka, brza digitalna ili CCD kamera visoke rezolucije, kompjuter i odgovarajući softver. Naš CASA sistem se sastoji od Olympus svetlosnog mikroskopa, Olympus CCD kamere, računara i CASA MacBiophotonics softvera koji objedinjava Sperm Counter, Sperm Tracker, Sperm Morphology, 2D i 3D Spot Tracker, Segmentation Tool, Image Enhancer, Virtual Dub i jos neke softverske podpakete.

Prednosti kompjuterske analize sperme odnose se ne toliko na brzinu obrade podataka, koliko na njihovu preciznost i neke nove kvalitete koje nije moguće dobiti “klasičnim” analizama. To se pre svega odnosi na određivanje procenta pokretljivih spermatozoida i kvantifikaciju kvaliteta njihove pokretljivosti. Radi lakše demonstracije prednosti koje CASA sistem pruza kliknite na link i pogledajte film 3 i 4. Svaka tačka na filmskim sekvencama je u stvari spermatozoid pod uvećanjem od 400X. U prikazanom vidnom polju ima oko 65 spermatozoida i osim nekoliko nepokretnih, stiče se utisak da su ostali pokretni.

Izračunavanje putanja i brzine

Izračunavanjem putanja kretanja svakog spermatozoida posebno može se videti da je jedna polovina spermatozoida ne-progresivno pokretna. Putanje prikazane plavom bojom predstavljaju putanje progresivno pokretnih spermatozoida koji se kreću brzinom većom od 20 mikorna/s, dok većina zelenih putanja (neke su označene crvenom strelicom) predstavljaju tzv. ne-progresivno pokretne odnosno cirkularno pokretne spermatozoide.

Na YT klipu mozete videti normalnu pokretljivost spermatozoida kao i njihove putanje na slikama. Na slikama putanja mozete videti da dominiraju progresivno pokretni spermatozoidi sa usmerenim putanjama. Filmovi i slike su uradjeni na nasem CASA sistemu.

CASA sistem je doprineo standardizaciji analize kvaliteta spermatozoida i maksimalnom isključivanju subjektivnih tumačenja u interpretaciji rezultata koji su ranije billi prisutni pri klasičnom analiziranju spermograma.

Primer kompletnog izveštaja spermograma i spermocitograma možete videti u PDF formatu.

Normalne vrednosti spermograma i spermocitograma možete videti u PDF formatu.